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(1.贵州师范大学化学与材料科学学院,贵州贵阳 550001；2.悉尼大学化学学院,澳大利亚悉尼 2006)
头花蓼(Polygonumcapitatum)为蓼科蓼属植物,以干燥全草入药。我国民间常用草药,药源丰富,分布于全国各地,主产于江西、广西、云南、贵州等地[1]。具有清热解毒、利尿通淋与活血止痛等功效,用于治疗痢疾、膀胱炎、风湿痛、跌打损伤、疮疡湿疹[2]。有研究表明,头花蓼提取物具有较好的抗氧化活性[3-5],黄酮类、酚酸类是头花蓼主要抗氧化活性成分[6-7]。目前对头花蓼的抗氧化活性研究主要集中在粗提物。为了深入研究头花蓼的抗氧化活性成分,本文对大孔树脂纯化后头花蓼多酚样品进行系统溶剂法分离萃取,采用羟自由基法、DPPH自由基法、ABTS自由基法对不同极性溶剂萃取物进行体外抗氧化实验,利用HPLC对乙酸乙酯部分主要活性成分进行初步的鉴定,以期为头花蓼抗氧化活性成分的进一步研究提供参考。
1 材料与方法1.1 材料与仪器头花蓼(Polygonumcapitatum)施秉三元威门公司,GAP种植基地,经贵阳中医学院王世清教授鉴定;二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)AR,东京化成株式会社;2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)AR,上海源叶生物有限公司;乙腈和甲酸(色谱纯)南通飞宇生物科技有限公司;其他试剂均为分析纯。
FZ102微型植物粉碎机天津泰泰斯特仪器公司;SHB-111S循环水式真空泵郑州长城科工贸公司;RE-52旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;A200S电子天平上海浦田春计量仪器公司;分析色谱柱(C18、4.6 mm×150 mm、5 μm)GL Sciences Inc、LC-15C型高效液相色谱仪日本岛津公司。
1.2 实验方法1.2.1头花蓼样品的制备参考文献[7]的方法制备头花蓼精多酚样品。称取一定量的精多酚样品,加水溶解,摇匀后加入一定量的石油醚进行振荡静置,待溶液完全分层后,倒出上层的石油醚相;下层水溶液按上述方法再萃取2次;剩余水溶液按上述步骤依次氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取得到头花蓼多酚的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及最后的水相溶液,将得到的萃取液合并进行减压浓缩,得到头花蓼多酚的萃取物的干粉置于干燥器中。
1.2.2总多酚的测定参考文献[8]的方法。以没食子酸为标准品,在最大吸收波长769 nm下测定标准系列的吸光度,绘制出标准曲线。称取一定量溶剂萃取物样品配成溶液,在同样条件下测定不同样品的吸光度,计算各溶剂萃取物样品的总多酚含量。各萃取物多酚含量测定结果的计算:
式中,W1各萃取物溶液测得多酚含量质量,g;W2提取液旋干物料的质量,g。
1.2.3抗氧化能力的测定
1.2.3.1清除羟自由基的能力测定精确称取头花蓼各个萃取物干粉样品0.0080 g溶于100 mL的容量瓶中,得到0.08 mg/mL的样品溶液。分别在具塞比色管中加入0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液1.0 mL,加入1 mol/L、pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)1.5 mL,充分混匀后,加入体积为1.0、1.5、1.75、2.0、2.5 mL的样液,混匀。再加入0.75 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL立即混匀,再加入1.0 mL 0.03%的H2O2,混匀后用蒸馏水定容至10 mL。在37 ℃恒温1 h,在510 nm处测定吸光度记为A1;用蒸馏水代替样液,测得吸光度A0;以蒸馏水代替0.03% H2O2,测得吸光度为A2[9-10]。计算清除率的公式为:
式中:A0蒸馏水代替样液的吸光度;A1样品组的吸光度;A2用蒸馏水代替H2O2对照组的吸光度。
1.2.3.2清除DPPH自由基能力测定精确称取头花蓼各萃取物干粉样品0.0050 g样品分别溶于100 mL容量瓶中,得到0.05 mg/mL的样品液。摇匀,备用。以无水乙醇为空白。配制0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液,取3.00 mL DPPH溶液,加入1、2.5、3.5、4.5、5.5 mL不同体积的样液,并用无水乙醇定容至10 mL。室温下反应5 min。在517 nm处测吸光度为A1;取3.00 mL DPPH溶液,加入无水乙醇定容至10 mL。反应5 min,在517 nm处测吸光度为A0,样液不加DPPH定容至10 mL吸光度为A2[11-12]。清除率计算公式如下:
式中:A0溶剂代替样品的吸光度;A1样品组的吸光度;A2不加DPPH对照组吸光度。
1.2.3.3清除ABTS自由基能力的测定准确称取头花蓼各个萃取物干粉样品0.0020 g分别定容于100 mL的容量瓶中,得到0.02 mg/mL的样液摇匀备用。配制14 mmol/L的ABTS溶液,先用蒸馏水配4.9 mmol/L的高硫酸钾溶液,分别将ABTS和高硫酸钾溶液按体积1∶1比例混合,每次用时用乙醇稀释混合液,在734 nm下测定吸光度为0.700±0.020时即可。取样液0.1 mL,分别与3.9 mL的ABTS自由基溶液混合均匀,用无水乙醇定容至10 mL室温下反应6 min,在734 nm处测定吸光度为A1,以无水乙醇代替ABTS自由基为A2。用等体积的无水乙醇代替样液,测其吸光度为A0[13-14]。计算公式为:
式中:A0溶剂代替样品的吸光度;A1样品组的吸光度;A2以无水乙醇代替ABTS对照组的吸光度。
1.3 乙酸乙酯萃取物的HPLC分析固定相:采用色谱柱C18(4.6 mm×150 mm、5 μm);流动相:A为水-甲酸(0.2%);B为乙腈,梯度洗脱,洗脱程序为:0～5 min:B 0%～5%,A 100%～95%;10～15 min:B5%～25%,A 95%～75%;15～25 min:B 25%～28%,A 75%～72%;25～37 min:B 28%～38%,A 72%～62%;37～55 min:B 38%～44%,A 62%～56%;55～60 min:B 44%～100%,A 56%～0%。检测波长为320 nm,柱温为35 ℃,体积流量0.6 mL/min,进样量10 μL。
1.4 相关性分析采用 Excel 2007软件处理数据并作图,通过SPSS20.0软件对清除自由基的IC50值与总酚含有量进行相关性分析。
2 结果与分析2.1 标准曲线以没食子酸为标准品做出标准曲线,以吸光度对浓度作图,得回归方程Y=0.1313X+0.0053,R2=0.9993,式中Y代表吸光度(A),X代表多酚浓度(mg/mL)。表明没食子酸质量浓度在1～5 μg/mL范围内与吸光度至呈线性关系,该方程可用于头花蓼多酚的定量测定。
图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve
2.2 各萃取物多酚含量测定结果由图2中可以看出精多酚样品经不同极性溶剂萃取分段后,各段的总多酚含量相差较大,乙酸乙酯部分总多酚含量最高为79.5%。
图2 各萃取多酚含量Fig.2 Polyphenol content of extracts
2.3 清除羟自由基的测定结果各萃取物清除羟自由基结果如图3。
图3 头花蓼不同极性萃取物清除羟自由基作用Fig.3 OH radical scavenging activity of different polar solvents of extracts from Polygonum capitatum
从图3中可以看出随着各样品体积的增加清除率也相应的增加。乙酸乙酯相对羟自由基清除能力明显高于其它相,甚至高于对照品没食子酸。石油醚相、氯仿相、正丁醇相、精多酚清除能力相差不大,水相的清除能力弱于其它相。其IC50值分别为:乙酸乙酯相(1.584 mL)<正丁醇相(2.21 mL)<氯仿相(2.62 mL)<石油醚相(2.656 mL)<精多酚(3.45 mL)<水相(4.402 mL)。
2.4 清除DPPH自由基的测定结果各萃取物清除DPPH自由基的结果如图4所示，乙酸乙酯相对DPPH清除能力明显高于其它相,但不如对照品没食子酸。石油醚相、氯仿相、正丁醇相清除能力弱于乙酸乙酯相但明显大于水相。相同的体积下,各萃取物及精多酚对DPPH自由基的清除率顺序为:乙酸乙酯相>精多酚>正丁醇相>氯仿相>石油醚相>水相,与其多酚含量顺序变化一致。其IC50值分别:乙酸乙酯相(2.393 mL)<精多酚(3.902 mL)<氯仿相(7.274 mL)≈正丁醇相(7.675 mL)<石油醚相(8.117 mL)<水相(10.496 mL)。
图4 头花蓼不同极性萃取物清除DPPH自由基作用Fig.4 DPPH radical scavenging activity of different polar solvents of extracts from Polygonum capitatum
2.5 清除ABTS自由基的测定结果清除ABTS自由基的测定结果如图5所示，可以看出:相同体积下,各萃取物及精多酚对ABTS自由基的清除顺序是:乙酸乙酯相>精多酚>正丁醇相≈氯仿相≈石油醚相>水相,其IC50值分别是乙酸乙酯相(0.091 mL)<精多酚(0.126 mL)<氯仿相(0.144 mL)<石油醚相(0.167 mL)<正丁醇相(0.169 mL)<水相(0.379 mL)。综上所述,各萃取物清除ABTS自由基能力最高的为乙酸乙酯萃取物,但其活性不如没食子酸,最弱为水相。石油醚相、氯仿相、正丁醇相相差不大,与各相萃取物的多酚含量顺序基本一致。
2.6 样品多酚与抗氧化活性的相关性由表1可知DPPH自由基和ABTS自由基、DPPH自由基与羟自由基、羟自由基与ABTS自由基的相关系数分别为0.818、0.589、0.808。DPPH与ABTS之间呈显著相关(p<0.05),而多酚含量与DPPH自由基IC50值呈显著负相关(p<0.01,r=-0.988),即多酚含量越高,IC50值越小清除DPPH能力越强。ABTS自由基IC50值、羟自由基IC50值与多酚含量呈一定相关(r=-0.742,r=-0.563)。多酚是清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基的主要活性物质,研究头花蓼多酚物质对于开发天然抗氧化剂有一定意义。
表1 相关性分析结果Table 1 Results of correlation analysis
注:**,在0.01水平(双侧)上显著相关；*,在0.05水平(双侧)上显著相关。
图5 头花蓼不同极性萃取物清除ABTS自由基作用Fig.5 ABTS radical scavenging activity of different polar solvents of extracts from Polygonum capitatum
2.7 乙酸乙酯萃取物化学成分由图6、图7高液图中可以看出槲皮苷的出峰时间,从峰面积来看其槲皮苷的含量是最高的,初步判断头花蓼乙酸乙酯部分含有槲皮苷。根据文献[15]可知槲皮苷的抗氧化能力较强,则其为头花蓼乙酸乙酯萃取物的抗氧化主要成分之一。
图6 乙酸乙酯萃取物高效液相色谱图Fig.6 HPLC picture of ethyl acetate
图7 槲皮苷高效液相色谱图Fig.7 HPLC picture of quercetin-3-rhamnoside
3 结论在清除自由基能力测定中,各萃取物均表现出一定的活性,并呈现量效关系。乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最强,水相最弱,清除DPPH自由基能力与多酚含量顺序均为乙酸乙酯相>精多酚>正丁醇相>氯仿相>石油醚相>水相,表明两者呈现显著相关(p<0.01),说明多酚是清除DPPH自由基的主要活性物质。清除羟自由基、ABTS自由基能力与多酚含量呈现较好相关,综上所述,乙酸乙酯相抗氧化活性最好,可作为分离抗氧化活性物质的重点,尤其需要关注其中多酚类物质。利用HPLC法对乙酸乙酯部分进行进一步的分离鉴定,表明槲皮苷为头花蓼乙酸乙酯萃取物抗氧化的主要成分之一。
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